25.08.2013

Анемия у котов

Рубрика: Коты
Автор: admin

Проба Кумбса, дослідження на ретровіруси і гемобартонельоз при анемії у котів

За матеріалами С. Такер, Дж. К. Мюррєй, Т.Г. Ноулз, коледж ветеринарної медицини і біомедичних наук, університет Колорадо, США

Вступ

Анемія котів нерідко трапляється у клінічній практиці і може мати різну етіологію (Wein gart and others 2004). Однією з причин є гемоліз, спричинений зв’язуванням антитіл і/або комплементу з поверхнею еритроцитів. У котів такий імуноопосередкований гемоліз (ІОГ) відзначається за наявності ряду захворювань, наприклад, гемобартонельозу, вірусного лейкозу, вірусного імунодефіциту, інфекційного перитоніту, новоутворень (наприклаlі лімфопроліферативних або мієлопроліферативних), застосування деяких препаратів, наприклад, пропілтіоурацилу або метімазолу, системного червоного вовчаку, гломерулонефриту, ізоеритролізису новонароджених або переливання несумісної крові.

Анемія у котів з інфекційними захворюваннями не обов’язково має імунну природу, оскільки при гемо-бартонельозі анемія не завжди супроводжується ауто-аглютинацією або позитивною пробою Кумбса, тоді як у котів з вірусним лейкозом можлива апластична анемія, аплазія еритроцитарного ростка або мієлодиспластичний синдром. Природа анемії при вірусному імунодефіциті вивчена гірше, однак анемія часто супроводжує це захворювання.

Раніше вважалося, що первинна ІОА, етіологія якої не визначена, рідко трапляється у котів (порівняно з собаками), проте недавні публікації змушують припустити протилежне. Діагноз ІОА звичайно грунтується на виявленні аутоаглютинації внаслідок зв’язування антитіл або комплементу з поверхнею еритроцитів в пробі Кумбса, хоча б частково, в той час як описані випадки псевдонегативних і псевдопозитивних результатів проби Кумбса при ІОА.

Якщо аутоаглютинація еритроцитів після промивання фізіологічним розчином з фосфатним буфером зберігається, це також вказує на присутність антитіл, зв’язаних з поверхнею еритроцитів, і використовується як додатковий критерій діагностики ІОА як у котів. Збереження аутоаглютинації після промивки застосовується на практиці для диференціації істинної аутоаглютинації та формування еритроцитарних стовпчиків.

До діагностичних критеріїв ІОА зазвичай відносять такі показники як, наприклад, наявність анемії, позитивну пробу Кумбса, аутоаглютинацію, регенеративну анемію і/або гемоліз. ІОА у котів досліджена недостатньо. В одному дослідженні для підтвердження діагнозу ІОА використовували позитивну пробу Кумбса або підтверджену постійну аутоаглютинацію еритроцитів.

Ситуацію утруднює відсутність методу діагностики, який можна використовувати в якості «золотого стандарту». Лише в одному попередньому перспективному дослідженні спеціально оцінювалися результати нашої проби Кумбса у котів, проте природа еритроцит-специфічних антитіл у 40 котів визначена лише частково у зв’язку з використанням обмеженої кількості реактивів Кумбса. У більш пізньому дослідженні пробу Кумбса проводили з набором реактивів, але на невеликій вибірці тварин без анемії (14).

Метою даного дослідження було проведення повної реакції Кумбса та оцінка постійної аутоаглютинації у великої групи тварин з анемією і без неї. Зв’язок між анемією, результатами проби Кумбса, постійною аутоагглютинацією, ретровірусною інфекцією і гемобарто-нельозом досліджували на 60 котах з анемією і 60 без анемії.

Матеріали і методи

Клінічний аналіз крові

Для дослідження відбирали кров на ЕДТА. Кожен зразок досліджували на автоматичному аналізатор1 Cell Dyn 3700 (Ебботт, Іллінойс, США). Для підрахунку лейкоцитарної формули та оцінки морфології еритро цитів, в тому числі наявності сфероцитів, готували мазки крові і фарбували їх за Райтом.

Крім того, за мазком перевіряли результат автоматичного підрахунку тромбоцитів, якщо останній був низьким (кількість тромбоцитів позначали як низьку, середню та високу). Проби крові відбирали у 60 котів з анемією (діагностували за концентрацією гемоглобіну Нb <8 г/дл (норма — 8-15 г/дл) і 60 котів без анемії (Нb> 8 г/дл). Тварин віком до одного року анемічними вважали за концентрації Нb <6 г/дл відповідно меж норми для котенят.

Проба Кумбса

Пробу Кумбса робили через 24 год. після відбору крові. Кров з ЕДТА суспендували у надлишку холодного фосфатно-сольового буфера (у співвідношенні 1:10) рН 7,4,0,1 М) і центрифугували (3500об/хв., протягом 3 хв.). Надосадову рідину і лейкоцитарну плівку видаляли, а потім знову суспендували еритроцитарний осад у фосфатно-сольовому буфері і центрифугували.

Еритроцити тричі промивали холодним фосфатно-сольовим буфером (4″ С). Потім готували 2,5% суспензію осаду промитих еритроцитів у фосфатно-сольовому буфері. Готували серійні розведення (від 1:5 до 1:10240) полівалентного котячого реактиву Кумбса в фосфатно-сольовому буфері, антикотячого імуноглобуліну GFc, антикотячого IgMFc і антикотячого IgAFc) (в об’ємі 25 мкл в мікропланшетах з круглодонними лунками). Антитіла проти котячого комплементу СЗb для даного дослідження не використовувалися.

У чотири лунки планшета вносили тільки фосфатно-сольовий буфер і використовували як негативний контроль. У кожну лунку вносили 25 мкл 2,5% суспензії еритроцитів і перемішували її, постукуючи планшетом по столу. Два планшети інкубували протягом години при 4′ С або 37* С.

Планшети розглядали на наявність аглютинації і записували титр, термічну активність і клас антитіл. Якщо аглютинація присутня у контрольних лунках з буфером, результати цієї проби Кумбса вважали такими, що не підлягають інтерпретації при даній температурі внаслідок аутоаглютинації.

Породні, статеві, вікові характеристики та клінічні дані

Копії історій хвороби кожної тварини отримували у ветеринарного лікаря. Записували вік, породу і стать, а також остаточний діагноз, якщо останній був встановлений вірогідно. Для постановки діагнозу «імуноопосеедкована анемія» звертають увагу на наступні критерії:

1)    наявність анемії, визначеної за концентрацією гемоглобіну;

2)    ознаки гемолізу (гемоглобінемія або гемоглобінурія за відсутності холестазу);

3)    відсутність інших причин руйнування еритроцитів або крововтрати;

4)    доказ позитивної реакції на терапію імуносупре-сорами.
Якщо брак інформації в історії хвороби не дозволяв поставити остаточний діагноз, цей випадок класифікували як невстановлений.

Кожен випадок, за якого вдавалося поставити остаточний діагноз, відносили до однієї з наступних категорій:

—    новоутворення і захворювання органів травлення;

—    панкреатит;

—    інфекційні захворювання;

—    непухлинні захворювання кісткового мозку;

-ІОА;

—    інші внутрішні незаразні захворювання;

—    хірургічні захворювання.

ІОА класифікували як первинну за відсутності основного захворювання (ретровірусна інфекція або ге-мобартонельоз, інші інфекції, новоутворення, переливання крові в минулому, введення препаратів, здатних викликати ІОА, тощо). Якщо вдавалося визначити першопричину, ІОА класифікували як вторинну.

Дослідження на гемобартонельоз і ретровірусні інфекції

Залишок крові з ЕДТА (не менше 0,1 мл) зберігали при температурі — 20′ С. ДНК екстрагували за допомогою готових наявних у продажу наборів (DNeasy, Кайаген, Кроулі, Великобританія) і проводили полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) на всі три види гемобартонелл кішок: Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum і Candidatus Mycoplasma turicensis.

Крім того, зразки досліджували на провіруси лейкозу та імунодефіциту методом ПЛР, а також на наявність котячої РДНК 28S в якості внутрішнього контролю для підтвердження наявності доступної для ампліфікації ДНК у зразках. Також включали відповідні позитивні (від кішок з діагностованою інфекцією) і негативні (від здорових кішок) контролі на кожного збудника, як при екстракції ДНК, так і при циклах ПЛР для виявлення будь-яких проблем при екстракції/ПЛР або контамінації.

Статистичний аналіз

Дані обробляли статистично. Порівнювали дані щодо постійної аутоаглютинації, результати проби Кумбса, наявності гемобартонельозу, вірусного лейкозу або імунодефіциту у котів з анемією і без. Вивчали зв’язок між позитивною пробою Кумбса при різних температурах і/або постійною аутоаглютинацією.

Порівнювали категорії захворювань, наявність збудників гемобартонельозу, вірусного лейкозу та імунодефіциту у котів з постійною аутоаглютинацією і без, а також у тварин з позитивною і негативною пробою Кумбса.

Під час аналізу результатів проби Кумбса при 4* С, тварин, у яких спостерігалося збереження аутоаглютинації при 4* С, виключали з аналізу, оскільки в цих випадках не можна було підтвердити специфічність реактиву. При інтерпретації результатів проби Кумбса враховували позитивний результат за будь-якого титру при 4 і 37* С, лише при 4° С і лише при 37* С, і кожен — з будь-якою антисироваткою.

Титри від 160 і вище оцінювали окремо. При порівнянні тварин з анемією і без неї використовували показник статистичної достовірності Р <0,0025; при порівнянні тварин з постійною аутоаглютинацією при 4* С і без, а також з позитивним і негативним результатом проби Кумбса -показник Р <0,0009.

Результати

Категорії хвороб, результати проби Кумбса, результати дослідження на гемобартонельоз і ретровірусні інфекції

У14 з 120 тварин (11,7%) діагноз не був встановлений, а в одному випадку до моменту відбору крові тварина було визнано клінічно здоровою. Кількість випадків кожного захворювання між групами тварин з анемією і без показана в табл. 1.

 

З 120 тварин у 13 (10,8%) відзначалася постійна аутоаглютинація в контрольних лунках з буфером при 4е С, що перешкоджало визначенням титрів в пробі Кумбса при 4* С через аутоаглютинацію у всіх лунках з дослідними пробами. Аутоаглютинації в контрольних лунках з буфером при 37* С не було в жодної тварини.

У пробі Кумбса з полівалентною сироваткою при 4е С у 96 котів (80%) був отриманий негативний результат, а у 11 котів (9,2%) — позитивний з титрами 10 (п = 4), 20 (п = 3), 160 (п = 2) і 320 (п = 2). З антисироваткою до ІgG при 4е С у 103 тварин (85,8%) отримано негативні результати, а у 4    тварин (3,34%) — позитивні при титрах 640 (n = 2), 1280 (n = 1) і 2560 (n = 1). З антисироваткою до ІgМ при 4е С у 79 котів (65,8%) отримано негативні результати, тоді яку 28 (23,3%) — позитивні при титрах 10 (n = 7), 20 (n = 12), 40 (n = 3), 80 (n = 4), 320 (n = 1) і 5120 (n = 1).

Антисироватки до ІgА використовувалася для проби Кумбса тільки в 99 випадках, коли обсяг сироватки крові був достатнім. З антисироваткою ІgА при 4′ С у 84 тварин (84,8%) отримано негативні результати, а у 7 (7,07%) — позитивні з титрами 10 (n = 4), 20 (n = 2) і 40 (n = 1). У 8 котів не вдалося визначити титри ІgА через спонтанну аглютинацію в контрольних лунках з буфером.

У пробі Кумбса з полівалентною антисироваткою при 37* С у 105 тварин (87,5%) був отриманий негативний результат, а у 15 (12,5%) — позитивний при титрах 5    (n = 1), 10 (n = 1), 20 (n = 2), 40 (n = 4), 80 (n = 4), 160 (n = 2) і 320 (n = 1). З антисироваткою до ІgG при 37* С у 106 котів (88,3%) отримано негативні результати, а у 14(11,6%) — позитивні при титрах 20 (n= 2), 80 (n = 2), 160 ( n = 2), 320 (n = 2), 640 (n = 1) і 1280 (n = 3).

З антисироваткою до ІgМ при 37* С у 119 котів (99,2%) отримано негативні результати і тільки у 1 тварини (0,8%) — позитивний (титр 160). В жодної з 99 тварин, досліджених з антисироваткою до ІgА при 37 * С не отримано позитивного результату.
Всі 120 зразків досліджували методом ПЛР на гемобартонельоз і ретровірусні інфекції. Контрольна ампліфікація РДНК 28S, була успішною у всіх 120 зразках; 13 зразків дали позитивну реакцію на Candidatus М. Haemominutum, негативну — щодо на М. haemofelis або Candidatus М. turicensis. Два зразки були позитивними щодо провірусу імунодефіциту котів, а вісім — щоо провірусу лейкемії.

Порівняння тварин з анемією і без

Не вдалось визначити показник Р для антисироват-ки ІgА при 37 «С, так як в жодній групі не було позитивної реакції.

При порівнянні тварин з анемією і без не було виявлено значних відмінностей у породному (77,6% безпородних + 22,4% породистих тварин і 58,6% безпородних + 41,4% породистих), статевому (56,1% котів + 43,9% кішок і 35,1% котів + 64,9% кішок) або віковому складі (5 [0,3-17] років і 6 [0,2-16] років). Середнє значення концентрації Hb складало 4,9 [1,5-7,8] г/дл у групі котів з анемією і 11,5 [8-15] г/дл у групі без анемії.

Виявлено значну відмінність в частоті постійної аутоаглютинації при 4* С між тваринами з анемією (13 з 60; 21,7% позитивних) і без анемії (0 з 60 позитивних) (Р <0,0001).

У таблиці 2 представлено аналіз порівняльних результатів проби Кумбса у тварин з анемією і без, коли будь-яка аглютинація при будь-якому титрі розглядалася як позитивна. У пацієнтів з анемією виявлена тенденція до позитивної проби Кумбса при 37* С (Р = 0,004) і позитивна реакція з полівалентною антисироваткою при 37* С (Р = 0,004), проте результати не були статистично достовірними.

Позитивний результат проби Кумбса[1]	3 анемією[2]	Без анемії	Значення Р[3] І
3 будь-якою антисироваткою при 4°С і/або 37 °С	19 з 47 (40,4%)	12 з 60 (20 %)	0,021
3 будь-якою антисироваткою лише при 4°С	19 з 47 (40,4%)	12 з 60 (20%)	0,021
3 будь-якою антисироваткою лише при 37°С	13 з 60 (21,7%)	2 з 60 (3.3%)	0,004
3 полівалентною антисироваткою лише при 4 °С	9 з 47 (19,1 %)	2 з 60 (3,3 %)	0,010
3 антисироваткою до ІgG лише при 4°С	2 з 47 (4,3 %)	2 з 60 (3,3 %)	0,100
3 антисироваткою до ІgМ лише при 4°С	17 з 47 (36,2%)	11 з 60 (18,3 %)	0,037
3 антисироваткою до ІgА лише при 4°С	4 з 32 (12,5%)	3 з 59 (5,1 %)	0,236
3 полівалентною антисироваткою лише при 37°С	13 з 60 (21,7%)	2 з 60 (3,3 %)	0,004
3 антисироваткою до ІgG лише при 37 °С	12 з 60(20 %)	2 з 60 (3,3 %)	0.008
3 антисироваткою до ІgМ лише при 37 °С	1 360(1,7%)	О з 60 (0%)	0,100
3 антисироваткою до ІgА лише при 37 °С	0 з 40 (0%)	О з 59 (0 %)

3 13 проб з позитивним результатом дослідження на Candidatus М. Haemominutum 10 були отримані від тварин без анемії, а 3 — від анемічних, при цьому значної різниці між групами не виявлено (Р = 0,075).

Граничне число циклів ПЛР у реальному часі у котів з інфекцією Candidatus М. haemominutum і анемією статистично не відрізнялися від такого у пацієнтів без анемії (32,6 ± 4,1 в порівнянні з 27,9 ± 4,6). У двох зразках було виявлено провірус імунодефіциту кішок, один з яких у анемічної кішки, а другий — у тварини без анемії.

З восьми зразків з позитивною реакцією на провірус лейкемії два були отримані від анемічних тварин, а шість — від тварин без анемії, без значних відмінностей між двома групами (Р = 0,0272). Гранич-не число циклів ПЛР в реальному часі при аналізі на провірус лейкемії у анемічних і нормальних тварин суттєво не відрізнялося (25,7 ± 10,8 і 31,9 ± 7,5).

Подальший опис котів з діагнозом імуноопосе-редкована гемолітична анемія (ІГА)

ІГА була діагностована у 11 котів. Вік цих тварин 0,5-14 років (дані по n = 10). Сім тварин (63,6%) були котами (4 кастровані) і 3 (27,3%) — кішками (дві кастровані), а в одному випадку стать не вказана. Вісім тварин (72,7%) були безпородними, 1 (9,1%) — британська короткошерста, а в одному випадку порода була не вказана.

У 9 котів була первинна ІГА, а у 2 — вторинна внаслідок інфекції Сапсіісіайіз М. Иаетотіпііїит і супутнього новоутворення шлунково-кишкового тракту. У всіх тварин з ІГА реакція при 4° С була позитивною: у 9 спостерігалася постійна аутоаглютинація, а у 2 випадках зареєстрована позитивна проба Кумбса з полівалентною антисироваткою (титри 20 або 160), антисироваткою до ІдМ (титри 20 або 40) і Ідв (титр 640, тільки 1 тварина).

Позитивна проба Кумбса при 37е С була у 9 з 12 тварин з ІГА з полівалентною антисироваткою (титри 20-2 тварини, 40 — 3, 80 — 2 і 160 — 2 тварини); з антисироваткою до Ідй (титри 80-2 пацієнти, 160 — 2, 320 — 3 і 1280 — 1 пацієнт) і антисироваткою до ІдМ (титр 160, тільки 1 тварина). Зв’язок між позитивною пробою Кумбса за різних температур і постійної аутоаглютинації

У кішок з постійною аглютинацією при 4° С ймовірність позитивної проби Кумбса була вищою (з будь-якою антисироваткою за будь-якого титру) при 37° С (9 з 13; 69,2%), ніж ймовірність негативної (4 з 105; 3,8 %) (Р<0,0001).

Якщо знехтувати тваринами з постійною аутоагл юти нацією при 4° С, у тварин з позитивною пробою Кумбса при 4° С ймовірність позитивної реакції при 37° С була також вищою (6 з 6; 100%), ніж негативної (25 з 101; 24,8 %) (Р <0,0001).

 Продолжение статьи

Вас также заинтересует это:

Comments (0)

Комментариев нет

Нет комментариев.

Добавить комментарий

Имя (required)

Е-маил (required)

Сайт