10.03.2013
Микоплазмоз животных
Рубрика: БолезниАвтор: admin
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ МИКОПЛАЗМОЗОВ ЖИВОТНЫХ
(Литературный обзор)
И. А. БАКУЛОВ, П. И. БАРЫШНИКОВ, В. М. КОТЛЯРОВ, Н. А. ЛАГУТКИН, А. Л. СЕМЕНИХИН
Всесоюзный НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии
Среди количественных иммунологических методов исследования широкое распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА). В последние годы опубликовано много работ, посвященных методическим проблемам ИФА и его использования в диагностике инфекционных болезней животных.
Значительно возросло значение метода в микробиологии и иммунологии, в силу того что он в большей степени отвечает основным требованиям, предъявляемым к методам экспресс-анализа.
К ним относятся высокая чувствительность, получение результатов в максимально короткие сроки, высокая специфичность, воспроизводимость и точность, позволяющие дать окончательный ответ при исследовании нативного материала в ряде случаев без биологического накопления и выделения чистой культуры возбудителя, производительность, простота, возможность количественного учета результатов и автоматизации, что позволяет применять его для проведения массовых обследований (Б. Б. Дзантиев и соавт., 1982; Voller et al., 1977; Feigner, 1978; Ward, 1979; Bakerman, 1980).
Известно значительное число модификаций ИФА в зависимости от природы определяемых веществ и целей исследования. В большинстве их используют фермент в качестве маркера одного из компонентов реакции антиген — антитело.
Признаки микоплазмоза
Основу методов второй группы, получивших название «твердофазный» или «гетерогенный» ИФА, составляет разделение компонентов реакции с использованием антител (антигенов), иммобилизованных на нерастворимом носителе.
Они в настоящее время получили более широкое практическое применение в серологической диагностике инфекционных болезней благодаря своей чувствительности, специфичности, быстроте постановки и автоматизации учета (Avrameas, Gilbert, 1971, Engvall, Perlman, 1973, Van Weeman, Schuurs, 1977).
Растворимые антигены или антитела присоединяются к твердой фазе с сохранением иммунологической активности, и фермент используется в качестве маркера иммунологической реакции, происходящей на твердой фазе. Фермент в данном случае служит катализатором иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально.
В настоящее время в целях оптимизации схем анализа разработаны математические модели конкурентного и «сэндвич» вариантов (Groome, 1980; Lettner, 1973). Наряду с теоретическими вопросами большое внимание уделяется разработке экспериментальных подходов оптимизации схем анализа.
По данным Mac Donald и соавторов (1979), разрабатываемые пути позволят при минимальном количестве экспериментального материала установить оптимальные концентрации антител (антигенов) на носителе, время проведения отдельных стадий анализа, температуру, рН, концентрацию меченых соединений.
Причины микоплазмоза
Для повышения чувствительности предложен вариант, при котором продукт расщепления субстрата обладает способностью к флуоресценции (Avrameas et al., 1979; Yolken et al., 1979). С такими субстратами успешно используют диагностикумы, содержащие щелочную фосфатазу (Сох et al.,1980) и пероксидазу (Pronovost et al.,1981). В этом случае даже минимальная степень распада субстрата может быть зарегистрирована чувствительным прибором.
Предложенный тест назван иммуноферментным флуоресцентным методом — ELFA. При распаде флуорогенного субстрата можно выявить до 5 — 10—19 молей фермента. Эта величина, как минимум, в 100 раз ниже предела, достигаемого в наиболее адекватных системах ИФА.
Еще большей чувствительностью обладают варианты, основанные на комбинировании иммуноферментного и радиоиммунологического анализов с использованием субстратов, меченных радиоактивными изотопами (Harris et al., 1979; Fields et al., 1981).
Однако эти варианты довольно трудновыполнимы в техническом отношении. Являясь комбинацией ИФА и РИА, они базируются на принципе двойного усиления сигнала. Поэтому, чтобы наряду со своей сверхвысокой чувствительностью они обладали достаточной воспроизводимостью и достоверностью, качество применяемых основных реагентов должно быть идеальным. Использование двух меченых реагентов значительно удорожает исследование.
Микоплазмоз заболевание
Данные литературы свидетельствуют о широком применении ИФА при выявлении антител и антигенов почти всех известных групп вирусов, вызывающих болезни животных (Yolken et at., 1978; Forgani et al., 1979; Toma et al., 1979; Payment et al., 1979; Hofmann et al., 1979).
Большие преимущества отмечены при проведении паразитологических исследований, например, при трихинеллезе свиней и эхинококкозе (Sanders et al., 1977; Pateraki et al., 1981), токсоплазмозе (H. В. Градковская и соавт., 1985; А. И. Грачева и соавт., 1980).
Методы иммуноферментного анализа пока не нашли широкого применения при бактериальных инфекциях. Имеется ряд объективных факторов, затрудняющих их использование в этом случае. Тем не менее в настоящее время твердофазный ИФА применяют для выявления антител при бруцеллезе (Byrd et al., 1979; Deyoe et al., 1982), столбняке (К. Л. Шаханина, 1982; Vos et al., 1979), стрептококковых, стафилококковых и пневмококковых инфекциях (Sanders et al., 1977; Robertsson et al., 1980; Л. H. Падюков и соавт., 1985; P. Д. Гавриляка и соавт., 1985), паратубер-кулезе (Yekomizo et al., 1983), лептоспирозе (Biancifiori et al., 1983).
Опубликованы работы по обнаружению специфических антител в сыворотке крови и антигенов в патологическом материале при различных микоплазмозах, а также определению видовой принадлежности мико-плазм с помощью иммуноферментного анализа.
Onoviran, Teylor-Robinson (1979) использовали ИФА для диагностики контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота. Они исследовали пробы сывороток крови в РСК, РА, РДП, реакции ингибиции роста и ИФА, взятые при исследовании животных, а также после экспериментального заражения и вакцинации. В половине проб сывороток, взятых при исследовании животных, в ИФА обнаружили специфические антитела, в то время как результаты других реакций были отрицательными. Кроме того, в ИФА специфические антитела в сыворотках выявляли через 19 мес после клинического переболе-вания и через 23 мес после вакцинации, в то время как другими тестами они не улавливались.
Panangala с соавторами (1982) исследовали сыворотку крови 27 быков в возрасте 9— 24 мес на наличие антител к Mycoplasma
bovigenitalium в ИФА и РИГА. По чувствительности ИФА в четыре раза превосходил РИГА. Однако в ИФА были отмечены слабые перекрестные реакции со специфическими сыворотками к Mycoplasma dispar, Mycoplasma alkalescens и Mycoplasma bovirhinis.
Для обнаружения специфических иммуноглобулинов против Mycoplasma bovis в сыворотке крови крупного рогатого скота Boothby с соавторами (1981) использовали ИФА. При оптимальных условиях он оказался быстрым, воспроизводимым, удобным и чувствительным.
За два часа можно исследовать около 40 параллельных проб. Специфические антитела в диагностических титрах были обнаружены на 7-й день у вакцинированных и на 14-й у естественно зараженных телят. Отмечена корреляция титров антител в ИФА и РИГА.
Heitmann с соавторами (1983) исследовали сыворотку крови крупного рогатого скота на наличие антител против Mycoplasma bovis в ИФА, РИГА и РСК. Титры специфических антител в ИФА были выше.
Лечение микоплазмоза
ИФА применяли для изучения иммунного ответа у телят на введение инактивированных формалином культур Mycoplasma dispar и Mycoplasma bovis. Иммуноглобулины Gi появлялись раньше иммуноглобулинов G2. Более высокий уровень иммуноглобулинов Gi к Mycoplasma dispar отмечен у животных старшего возраста, к Mycoplasma bovis в зависимости от возраста он изменялся незначительно (Howard et al., 1983).
Известно успешное применение ИФА для выявления антител в сыворотке крови лошадей к микоплазмам различных видов и ахолеплазмам (Ammar et al., 1980; Kirch-Hoff et al., 1982).
Favier с соавторами (1982) применили ИФА для одновременного определения антител в сыворотке крови коз против Mycoplasma mycoides, Mycoplasma capricolum и Mycoplasma agalactiae. В качестве антигена использовали смесь экстрактов белка мико-плазм этих видов. Отмечая высокую чувствительность метода, они рекомендовали его для массового обследования коз.
В качестве вспомогательного теста Schaeren с соавторами (1982) применили ИФА при диагностике инфекционной агалактии коз. Антигеном служил экстракт из биомассы Mycoplasma agalactiae, полученный в результате обработки ее твином-80. Установлена корреляция и сравнимая чувствительность ИФА и РСК.
Armstrong с соавторами (1983) сравнивали ИФА, РИГА и РСК при определении специфических антител к Mycoplasma hyopneu-moniae у поросят, зараженных полевым изолятом этого возбудителя. Наиболее чувствительным и практически приемлемым оказался ИФА.
Bruggmann с сотрудниками (1977) использовали модифицированный иммунопероксидаз-ный метод для количественного определения антител против Mycoplasma suipneumoniae у экспериментально зараженных свиней. Исследовали сыворотки 24 поросят 12-недельного возраста. Специфические антитела обнаруживали за 5 нед до клинического проявления болезни и спустя 50 нед после переболевания.
При выявлении антител к Mycoplasma synoviae и Mycoplasma gallisepticum в сыворотке крови цыплят, инфицированных микоплазмами этих видов, по мнению Ansari и соавторов (1983), Imada и соавторов (1982), Opitz и соавторов (1983), ИФА — чувствительный и специфичный тест.
Имеются сообщения об успешном применении ИФА для идентификации ахолеплазм и микоплазм (Polak-Vogelzang et al., 1978), выявления специфических антител против уреаплазм (Brown et al., 1983; Wiley et al., 1984) и спироплазм (Rajn et al., 1981), а также их внутривидового серотипирования (Quin et al., 1981; Turuner et al., 1982; Williamson et al., 1982).
ИФА применяли для индикации мико-плазменных антигенов в патологическом материале (Bruggmann et al., 1977; Thorns et al., 1980). Принцип метода в данном случае заключается в связывании фермента с иммуноглобулином с последующим присоединением полученного конъюгата к антигену и выявлении этого комплекса цитохимической реакцией.
Для этого кусочки замороженных органов или мазки-отпечатки обрабатывали пероксидазным конъюгатом и добавляли субстрат. В случае присутствия специфического возбудителя под микроскопом хорошо видны красно-коричневые точки.
Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют выявлять единичные микоплазмы в тканях и клетках (Hill, 1978). Преимущество ИФА в том, что все наблюдения проводятся под обычным световым микроскопом (Giger et al., 1977).
Freeman и соавторы (1983) предложили полуавтоматический вариант ИФА для диагностики микоплаэменной пневмонии свиней, что позволяет исследовать значительно большее число проб.
Заключение.
Преимуществами иммуноферментного анализа перед другими серологическими тестами являются высокая степень чувствительности, обеспечивающая затрату минимальных количеств антигена или антител, количественная оценка результатов, исключающая субъективизм, возможность автоматизации рабочего процесса.
Данные разностороннего изучения твердофазного ИФА при микоплазменных инфекциях свидетельствуют о возможности его использования в ветеринарии для диагностики микоплазмозов животных.
Однако для этого необходимо иметь высокоочищенные препараты ферментов, высокоактивные и специфичные сыворотки на максимально очищенные препараты микоплазм или отдельные микоплазменные белки, чистые антитела к этим микоплазмам; приготовить высокоактивные иммуноферментные конъюгаты, работающие в разведении 1:1000— 1:2000; при проведении массовых исследований необходимо иметь аппаратуру с автоматической записью результатов.
Вас также заинтересует это:
Comments (0)
Комментариев нет
Нет комментариев.
