03.09.2015
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИБРИОЗА ЖИВОТНЫХ
Рубрика: БолезниАвтор: admin
За последние годы в нашей стране вибриоз животных привлекает все большее внимание специалистов.
Распространенное ранее мнение о немногочисленности видов микробов рода Vibrio и ограниченности их роли в этиологии различных болезней животных не соответствует действительности.
В литературе описаны половая вибрионная инфекция крупного рогатого скота и овец, зимняя дизентерия, или черный понос телят, вибрионная дизентерия свиней, вибрионная инфекция кур, вибрионный энтерогепатит кур и индеек.
Носителями различных видов вибрионов могут быть, кроме перечисленных животных; также мыши, крысы, хомяки, лисицы, кенгуру и др.
Наряду с патогенными вибрионами у животных могут быть обнаружены непатогенные вибрионы, что без определения вида может вызвать необоснованную тревогу. К сожалению, до сих пор в практике работы лабораторий при диагностике вибриоза не всегда определяют тип выделенной вибрионной культуры.
При изучении вибриоза крупного рогатого скота было установлено (Akkermans, Terpstra, Bryner, Frank, Florent, Vandeplassche, В. В. Павловский), что в организме этого вида животных чаше всего обнаруживают три типа вибрионов, из которых только один является возбудителем болезни, поражающей половые органы и вызывающей расстройство их деятельности.
Существование типов вибрионов, сходных морфологически, но различающихся по другим свойствам, признано учеными различных стран.
По принятой номенклатуре, предложенной Florent (1958), эти вибрионы получили наименование: Vibrio fetus venerelialis (тип I), v. f. intestinalis (тип II) и v. bubulus (тип III).
Первый из них относится к паразитам и является возбудителем заболевания, передающегося в основном половым путем, вызывающего симптоматическое бесплодие вследствие поражения половых органов коров и препятствующего оплодотворению, и аборты на различных стадиях стельности.
Второй тип вибрионов — постоянный обитатель кишечника и желчного пузыря крупного рогатого скота, который при попадании в матку стельной коровы способен вызвать воспалительный процесс, который может завершиться спорадическим абортом и изгнанием плода.
В дальнейшем абортировавшая корова оплодотворяется, никаких расстройств деятельности половых органов у нее не происходит и у других коров стада клинический симптом бесплодия вследствие этой болезни не наблюдается.
Однако вибрионы типа II являются причиной массовых абортов овец, которые заражаются только в период суягности алиментарным путем.
Этот факт неоднократно был подтвержден при экспериментальном заражении телок (В. В. Павловский, И. Г. Левина, 1960—1962) и в хозяйствах («Горки Ленинские», «Манихино» и др.), в которых обнаруживали вибрион этого типа. Передача возбудителя болезни от крупного рогатого скота овцам не отмечена.
Вибрионы типа III относятся к сапрофитам, обитают в половых органах крупного и мелкого рогатого скота, но патологических изменений у животных не вызывают.
В литературе описаны также вибрионы, сходные по морфологическим признакам и физиологическим свойствам с возбудителем половой инфекции крупного рогатого скота, но отличающиеся от него способностью культивироваться на искусственных питательных средах в аэробных условиях, тогда как указанные выше три типа вибрионов относятся к микроаэрофилам, нуждающимся, особенно в первых генерациях, в понижении до 5—6% кислорода или добавлении 10—15% углекислого газа.
В связи с этим для правильной диагностики вибриоза животных необходимо получить чистую культуру вибрионов и ее идентифицировать.
Лучшим материалом для бактериологического исследования является свежий выкидыш, поступивший в лабораторию не позднее 24 часов. При отсутствии плода исследуют слизь, взятую у самок из канала или из устья шейки матки, а у самцов из свода препуциальной полости, а также сперму.
Перед взятием материала для исследования в первую очередь необходимо выявить животных, наиболее пригодных для этой цели, так как вибриононосительство у большинства коров непродолжительно. Для такого отбора пользуются методом клинико-эпизоотологического обследования, разработанного нами на основе комплексного изучения животных в неблагополучных по вибриозу хозяйствах.
Сущность этого метода сводится к выявлению коров и нетелей, которые в течение одного-трех месяцев не были оплодотворены или абортировали. Из числа производителей выбирают таких животных, оплодотворяющая способность спермы которых без видимых причин за последние месяцы снизилась.
Поскольку вибрионная инфекция у крупного рогатого скота передается в основном половым путем, предполагаемым моментом заражения является дата первого безрезультатного осеменения после отела.
Для исследования отбирают быков, у которых коэффициент оплодотворяемости спермы (количество осеменений, затраченных в среднем на оплодотворение одной коровы) превышает три. Этот коэффициент вычисляют путем деления общего числа осеменений на число животных, ставших беременными за последние четыре-шесть месяцев.
Например, спермой быка Алмаз за последние пять месяцев было проведено 34) осеменение 123 коров, причем из них оказались стельными 96. Отсюда коэффициент равен 341:96 = 3,5.
Бактериологически исследуют препуци-альную слизь и сперму. Учитывая слабую устойчивость возбудителя вибриоза к факторам внешней среды, высевы на питательные среды препуциальной слизи необходимо проводить непосредственно в хозяйстве не позднее одного-двух часов после взятия материала.
Чтобы избежать загрязнения проб слизи посторонней микрофлорой, затрудняющей или полностью препятствующей росту вибрионов, материал следует брать только при помощи специальных инструментов. Сперму следует отправлять в лабораторию в термосах на льду немедленно после ее получения.
Высевы полученного материала проводят на плотную и полужидкую питательные среды.
Плотная среда состоит (в процентах) из мясной воды (25, лучше использовать мышцу сердца), печеночного настоя (25), воды (50), пептона (I), хлористого натрия (0,5), стерильной дефибринированной крови (7—10) крупного рогатого скота или барана, прогретой при 73° в течение нескольких минут до начала побурения. Вместо цельной крови может быть использован аминопептид-2 (10% к объему среды). Применяют также среду Мартена.
В качестве веществ, стимулирующих рост вибрионов, к среде можно добавить экстракт дрожжей — 3%, тиогликолат натрия или тиогликолевой кислоты — 0,03%, L-цистина или цистеина — 0,02%, глютатиона — 0,005%. Агар, в зависимости от сорта, добавляется к плотной среде в количестве 2—3%.
Полужидкую среду готовят на той же основе с добавлением к ней 10% фосфатного буфера, 5% аминопептида-2 и 0,1— 0,15% агара.
К полужидкой среде, рекомендованной Ленинградским НИВИ, добавляют 0,25% гликокола. По нашим данным, вводить глнкокол в среду не следует, так как эта аминокислота, будучи безразличной для вибрионов типов II и III, тормозит рост возбудителя полового вибриоза (тип I).
Материал высевают минимум на две чашки Петри с плотной средой и на две пробирки с полужидкой средой. Одну из чашек засевают непосредственно слизью с тампона, а вторую бульоном из пробирки, куда предварительно опускают взятую пробу материала.
После засева на поверхность среды наносят несколько капель полужидкой среды, что препятствует высыханию посевного материала и создает более благоприятные условия для развития вибрионов.
Посев на полужидкую среду с помощью пастеровской пипетки проводят бульоном, в котором ополаскивают тампон со слизью. При этом конец пипетки опускают примерно на 1 см ниже поверхности среды.
Это делают для того, чтобы посторонняя микрофлора, находящаяся в пробе слизи, осталась в глубине среды, тогда как вибрионы вследствие своей подвижности поднимаются к поверхности.
Во избежание гибели вибрионов в тонком слое посевного материала от высыхания и воздействия кислорода воздуха засеянные чашки и пробирки не позже чем через один-два часа помещают в микро-анаэростаты, последние закрывают и из них откачивают воздух до остаточного давления 230 мм.
В таком разреженном воздухе содержится примерно 5—6% кислорода, что является оптимальной его концентрацией для вибрионов. После доставки посевов в лабораторию желательно добавить в микроанаэростат 10%’ углекислого газа, а затем поместить его в термостат при 37°.
Просмотр посевов начинают через 48 часов. Первичный рост вибрионов на плотной среде характеризуется нежным, еле заметным бесцветным или слегка голубоватым налетом или отдельными очень мелкими колониями.
На полужидкой среде непосредственно под поверхностью образуется тонкое серо-белое кольцо, которое при наклоне пробирки оставляет на стекле мажущийся сметанообразный осадок.
В высевах из препуциальной слизи ца плотной среде нередко обнаруживают колонии вибрионов, растущие отдельно от сопутствующей микрофлоры, что позволяет получить чистую культуру уже во второй генерации.
В случае невозможности отделить колонии вибрионов в первичном высеве пользуются методом Флорана, несколько модифицированным в нашей лаборатории. Для этого в пастеровскую пипетку вначале насасывают до конца капилляра стерильную полужидкую среду.
Затем подсасывают микробный рост из загрязненной культуры в верхнем слое полужидкой среды в пробирке с таким расчетом, чтобы эта культура заполнила собой капилляр пипетки, а находившийся ранее в капилляре слой полужидкой среды поднялся до половины цилиндра пипетки.
После этого капилляр пипетки запаивают на огне горелки и пипетку помещают в микроанаэростат, а затем выдерживают посев в; условиях, указанных выше. В силу своей подвижности вибрионы поднимаются вверх, тогда как неподвижная микрофлора остается внизу.
Как вспомогательный тест при диагностике вибриоза может быть использован серологический метод: исследование сыворотки крови абортировавшей коровы реакцией агглютинации (РА) с антигеном Витебской биофабрики.
При наличии вибрионной инфекции титр сыворотки в первые 10—15 дней после аборта достигает 1 : 400 и выше, тогда как у коров, абортировавших по другой причине, титр не превышает 1 : 100. Этот метод достоверен, так как антиген строго специфичен и не реагирует с антителами, образовавшимися под влиянием вибрионов других типов.
Нами предложен также метод идентификации вибрионов без получения чистой культуры, основанный на типовой специфичности каждого из упомянутых выше типов вибрионов.
Для типирования имеющуюся загрязненную культуру вибрионов- на полужидком агаре (ПЖА) вводят подкожно взрослому кролику в объеме 1 мл (лучше 2 мл) двукратно с промежутком три-пять дней. Через пять дней после второй инъекции сыворотку кролика исследуют методом РА с фабричным антигеном, который готовят только из штаммов вибрионов типа I.
РА ставят в разведениях от 1 : 25 до 1 : 200. При наличии в исследуемом материале возбудителя вибриоза сыворотка обработанного кролика будет агглютинировать типовой антиген в титрах 1 : 100—1 : 200.
При наличии вибрионов других типов показания РА будут отрицательными во всех разведениях сыворотки. В дальнейшем после организации производства антигенов всех трех типов станет возможным типирование таким способом не только одного, но и всех трех типов вибрионов.
Чистая культура вибрионов может быть типирована также и на основе биохимического анализа ее физиологических свойств. Каталазную активность определяют путем * добавления к исследуемой культуре на ПЖА 4—5 мл 3%-ной перекиси водорода и тщательного смешивания их. При наличии каталазы в пробирке с культурой образуется пена (перекись водорода разлагается с выделением кислорода). Проба считается положительной при образовании пены (не менее 5 мм) над уровнем смеси при диаметре пробирки 12 мм.
Для проверки культуры на способность образования сероводорода используют мясопептонный бульон (МПБ), ПЖА Мартена с введением в пробирку полоски фильтровальной бумаги, пропитанной насыщенным раствором уксуснокислого свинца и высушенной на воздухе.
При наличии сероводорода нижний конец полоски, обращенный к среде, темнеет. Более чувствителен способ определения сероводорода на ПЖА Мартена с 0,02% L-цистина. Результаты учитывают ежедневно на протяжении пяти суток.
Большое значение имеют посевы на ПЖА с 1% глицина (гликокола), 3,5% хлористого натрия, 4%: желчи крупного рогатого скота, а также определение характера роста культуры при посеве уколом в полужидкую среду, содержащую 0,5% агара (табл.).
| Вид вибриона | Каталаза | Сероводород | Рост на ПЖА, с добавлением | |||||
| МПБ | ПЖА
С ЦИСТИНОМ |
глицина | желчи | хлористого натрия | 0,5% агара (укол) | |||
| V. | f. venerealis | + | — | -(±) | — | + | — | Вверху |
| V. | f. intestinalis | + | -(+) | ++ | + | + | — | То же |
| V. | bubulus | = | ++ | ++++ | + | — | + | ‘Повсюду |
Из таблицы видно, что V. f. venerealis каталаза активен, на МПБ сероводород не выделяет, а на ПЖА с цистином могут быть следы газа на четвертые-пятые сутки, не растет на ПЖА с глицином и с солью и хорошо растет на ПЖА с желчью. Культуры V. f.intestinalis каталаза активны, на ПЖА сероводорода не выделяют или образуют его в небольшом количестве, но на ПЖА с цистином уже на вторые-третьи сутки почернение полоски хорошо заметно. Культуры растут на ПЖА с глицином и желчью, но не растут на солевой среде.
При посеве уколом V. f. veneralis и V.f. intestinas растут только около поверхности среды. V. bubulus каталаза неактивен, бурно образует сероводород, растет на ПЖА с глицином и солью, но не растет на среде с желчью. При посеве уколом рост наблюдается во всей толще среды.
Необходимо предупредить, что для биохимического анализа требуются вещества высокой химической чистоты, не подвергавшиеся, изменениям вследствие воздействия света, влаги, высоких и низких температур и других факторов.
При диагностике вибрианной инфекции у овец основным объектом исследования являются абортированные плоды и их оболочки. Выделение культур в чистом виде не представляет особого труда.
Методы идентификации такие же, как описано выше, только при использовании сред для выращивания и типирования используют соответствующие ткани (печень, желчь, кровь) от овец. Возбудитель болезни относится к типу II (V. f. intesinalis), однако желательно дифференцировать выделенные штаммы, поскольку имеются данные о возможности инфицирования овец вибрионами типа I (V. f. venerealis), что представляет значительно-большую угрозу.
Для диагностики вибрионного энтерогепа-тита кур и индеек высевы делают из печени, желчного пузыря, головного мозга, сердца и яичников. В качестве компонентов сред используют печень, желчь и кровь курицы.
В лабораторном типировании культур нет необходимости, так как болезнь, вызванная V. metschnikovi, отличается от вибрионного энтерогепатита по клиническим признакам. Первая более доброкачественна, поражает цыплят до двухмесячного возраста и характеризуется диареей и образованием небольших некрозов в печени и легких.
Вторая инфекция характеризуется обширными некрозами печени и легких, отечностью сердца и поражением яичников. Яйценоскость кур понижается до 35%.
При проведении диагностических-исследований наряду с данными лабораторного анализа всегда следует учитывать клинико-эпизоотологическую ситуацию в хозяйстве.
В. В. ПАВЛОВСКИЙ, кандидат ветеринарных наук И. Г. ЛЕВИНА, научный.сотрудник
Государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов
Вас также заинтересует это:
Comments (0)
Комментариев нет
Нет комментариев.
