28.02.2014
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕДОВУЛЯЦИОННЫХ ООЦИТОВ У ТЕЛОК МЕТОДОМ АСПИРАЦИИ
Рубрика: КРСАвтор: admin
И. ЛАУРИНЧИК, А. В. ОВЧИННИКОВ, П. ГРАФЕНАУ, Ю. ПИВКО
Совместная чехословацко-советская лаборатория по биотехнологии в животноводстве, НИИЖ, г. Нитра
Чехословацкая Социалистическая Республика
Внедрение в практику животноводства метода пересадок эмбрионов позволяет интенсивно использовать генофонд выдающихся животных. В последнее десятилетие специалисты широко исследуют возможности получения жизнеспособных эмбрионов из незрелых ооцитов — методом их культивирования в условиях in vitro.
Успешное внедрение метода позволит получать большие популяции потомков от уникальных животных.
Метод культивирования ооцитов in vitro включает контроль процессов гаметогенеза, оплодотворения зрелой яйцеклетки и последующего развития зиготы до зародышевой стадии. Результаты экспериментальных исследований культивирования ооцитов в условиях in vitro пока еще недостаточно успешны.
Основным источником незрелых ооцитов для культивирования их вне организма служат яичники коров, полученные после убоя животных. С этой целью ткани яичников иссекают и с помощью микроскопа находят ооциты.
Подобная технология получения женских гамет очень несовершенна. Поскольку стадии развития найденных ооцитов различны, то и дальнейшие условия культивирования гамет также должны отличаться. Не способствует полноценному созреванию гамет в условиях in vitro и их контаминация с неживыми измельченными тканями яичника.
Нами была поставлена задача освоить методику получения незрелых ооцитов методом лапароскопической аспирации предовуляционных фолликулов и изучить возможности многократного использования телок в качестве доноров ооцитов.
Опыты проводили на телках симментальской породы в возрасте 13—24 мес с массой тела 300—550 кг. Для множественного роста фолликулов применяли фоллигон, фоликотропин, ФСГ-п по общепринятой схеме. Для получения ооцитов фолликулы аспи-рировали во время эструса телок перед началом овуляции, то есть через 40—45 ч после инъекции им простагландина (эстрофан, Spofa).
Лапароскопический метод оценки состояния яичников и получение предовуляционных ооцитов у крупного рогатого скота, который впервые разработали Lamond et al (1965), мы осуществляли двумя способами: паралюм-бальным (в положении животного стоя) и медиовентральным (в положении лежа на спине).
За 24 ч до операции животных не кормили, а за 12 ч прекращали поить. Операционное поле готовили по общим правилам. Для аспирации ооцитов использовали необходимые приборы и инструменты (рис. 1).
инструменты ветврача
Рис. I. Приборы и инструменты, используемые для аспирации ооцитов:
1 — эндоскоп с осветительным устройством (1а);
2 — троакар с канюлей для эндоскопа; 3— игла для аспирации фолликулов;
4 — фиксационные клеши;
5 — троакар с канюлей для клешей;
6 — прибор, создающий вакуум при аспирации фолликулов
Паралюмбальный способ аспирации ооцитов. За 10 мин до операции телкам внутримышечно вводили ромпун (0,1—0,2 мл на 100 кг массы тела). Места операционного вмешательства обезболивали послойной инфильтрацией 20 мл 2 %-ного раствора прокаина.
В отдельных случаях животным делали паравертебральную анестезию. Для расслабления мускулатуры матки и связок яичника внутримышечно инъецировали 10—15 мл Uterus relaxans (ФРГ). Хирургическое вмешательство осуществляли на брюшной стенке с правой стороны разрезом кожи в двух местах.
Первый разрез шириной 2 см делали на месте соединения abdominis lateralis, femoralis, genus lateralis. В раневое отверстие вставляли троакар и тупой перфорацией мышц и брюшины в каудальном направлении достигали брюшной полости.
Оставив канюлю в ране, вместо троакара вводили эндоскоп. Второй разрез кожи (1 см) делали на 5— 7 см каудальнее голодной ямки. Перфорировали брюшную стенку троакаром в каудовентральном направлении, в сторону расположения эндоскопа. Затем троакар заменяли фиксационными клещами.
С помощью эндоскопа определяли локализацию одного из яичников и фиксировали его клещами за lig. mesovarium.
В раневое отверстие, где расположен эндоскоп, вводили аспирационную иглу. Через нее под контролем эндоскопа аспирировали фолликулы. При этом фолликулярную жидкость и ооциты при помощи вакуума засасывали в герметично закрытую пробирку.
Для удобства аспирации фолликулов яичник поворачивали фиксационными клещами вокруг их оси. Аналогично находили другой яичник и аспирировали фолликулы. В случаях затруднения при нахождении и фиксации яичников проводили мануальную коррекцию их per rectum.
После завершения аспирации через канюли ввобрюшную полость антибиотики. Операционные швы накладывали только на кожу.
Медиовентральный способ аспирации ооцитов (рис. 4).
Рис. 4. Аспирация ооцитов медиовентральным способом
Для предупреждения анафилаксии подкожно инъецировали животным атропин (5—7 мл). Затем внутривенно вводили комбелен (1 мл на 100 кг массы тела). Операцию выполняли под галотановым наркозом (применяли Narkotan, Spofa).
Иногда места.пункций брюшной стенки обезболивали послойной инфильтрацией 2 %-ного раствора прокаина (10 мл). Маточный релаксан (10— 15 мл) инъецировали внутримышечно.
Оперативный доступ к яичникам осуществляли в двух участках брюшной стенки . Для введения эндоскопа разрез кожи (2 см) делали с левой стороны на расстоянии 5— 7 см латеральнее белой линии и на 2 см краниальнее основания вымени. Тупой перфорацией троакар с канюлей направляли в брюшную полость каудально.
Для фиксационных клещей кожу (1 см) разрезали справа на 5 см латеральнее белой линии и на 7—10 см краниальнее основания вымени. Троакар при этом вводили также в каудальном направлении. Дальнейшие манипуляции, связанные с аспирацией фолликулов, одинаковы с таковыми при паралюмбальном способе.
В наших экспериментах подвергали лапароскопической аспирации фолликулов яичников 20 телок-доноров (по 4—5 раз каждую). Получали от 80 до 100 % ооцитов из общего числа созревших предовуляционных фолликулов. Интервал между операциями составлял 6—8 нед.
Случаев заметного снижения воспроизводительной функции у телок не наблюдали. Не выявлено также случаев ухудшения общего состояния здоровья животных в послеоперационный период. Экспериментальные наблюдения показали, что операция по извлечению фолликулярных ооцитов паралюмбальным способом несложна.
Однако есть несколько моментов, отрицательно влияющих на проведение аспирации. Иногда после применения ромпуна животное не может самостоятельно стоять долгое время (1,5 ч). При фиксации телки ремнями возникает легкая тимпания, затрудняющая манипуляции с инструментами.
У отдельных животных фиксация яичников клещами невозможна из-за сокрашений матки и связок яичника. В таких случаях показано применение медиовентральной лапаротомии (Holland et al., 1981).
Этот способ аспирации фолликулов более сложный, но позволяет достичь лучшего обездвиживания животных и предохраняет их от осложнений со стороны органов дыхания при даче животным барбитуратов. Меньшая толщина брюшной стенки упрощает при этом способе манипуляции инструментами.
Wishart et al. (1983) для облегчения манипуляций инструментами нагнетали в брюшную полость индифферентный газ. При операцих следует добиваться, чтобы задняя часть тела животных располагалась как можно выше, что значительно облегчает определение места локализации яичников.
Использование лапароскопической техники представляется нам перспективным при исследовании процессов фолликулогенеза, а также в научно-исследовательской и практической ветеринарии.
Obtaining preovulatory oocytes in heifers by aspiration method I. laurinchik, A. V. Ovchinnikov, P. Grafenau, Yu. Pivko
SUMMARY
The aim of this investigation was to master the method for obtaining premature oocytes by laparoscopic aspiration of pre-ovulatory follicles and to study the possibility of repeated using heifers as donors of oocytes. The laparoscopic estimation of ovary status and obtaining the pre-ovulatory oocytes were conducted using two methods, paralumbar and medioventral ones.
There were no marked decrease of reproductive function in heifers and aggravation of general status of animals during post-operation period. The operation on paralumbar obtaining follicle oocytes is quite simple. Application of laparoscopic technique seems to be perspective both in researches and in practice.
Вас также заинтересует это:
Comments (0)
Комментариев нет
Нет комментариев.
