21.01.2014

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ АЭРОБНЫХ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИИ

Рубрика: Болезни
Автор: admin

В. С. РУСАЛЕЕВ Кустанайский СХИ

К настоящему времени выделены и изучены бактериальные вирусы различных видов микроорганизмов. Некоторые из них нашли применение в диагностической практике, часть используют в качестве модели при решении общебиологических проблем.

Желательно расширять круг модельных систем за счет фагов аэробных спорообразующих бактерий, что способствовало бы выявлению новых, ранее неизвестных свойств того или иного бактериального вируса и получению более полной его биологической характеристики. Вместе с тем весьма актуальна и сама проблема фагоидентификации и дифференциации близкородственных видов бацилл.

С целью изучения возможности использования для идентификации и типирования отдельных видов аэробных спорообразующих микроорганизмов мы предприняли попытку изолировать из различных образцов почвы бактериальные вирусы, активные в отношении представителей этой группы.

Материалы и методы. Для выделения фагов использовали различные образцы почвы, а в качестве питательных сред — дрожжевой бульон, 1,5 %-ный и 0,7 %-ный дрожжевой агар. Для разведения и хранения выделенных агентов пользовались средой SM (5,8 г NaCI, 2 г MgS04- 7Н20, 50 мл 1М Трис-НСl, 5 мл 2 %-ной желатины, до 1 л дистиллированной воды, рН 7,4—7,5).

В качестве индикаторных культур применяли Bacillus anthracis, Bacillus megatherium, Bacillus mycoides, Bacillus cereus. Bacillus pumilus. Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis. Культуры бактерий и фаги хранили при 4—6 °С.

Фаги из почвы выделяли по несколько модифицированному нами методу Е. В. Груз (1964), Для этого навеску почвы (5 г) размешивали в 100 мл бульона и инкубировали 6 ч при 37 °С, 2 мл полученной суспензии переносили в колбу с 50 мл бульона, и добавляли 2 мл 4-часовой культуры соответствующего индикаторного штамма.

В контрольные колбы с бульоном добавляли в одну 6-часовую бульонную суспензию почвы, а в другую индикаторную культуру. Посевы инкубировали 18 ч при 37—38 °С. Затем содержимое колб центрифугировали при 4— 5 тыс. об/мин 15—20 мин, супернатант фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и исследовали на наличие фага, нанося каплю фильтрата на газон индикаторной культуры.

Через 18—20 ч инкубирования в месте нанесения капли исследуемого фильтрата наблюдали полный лизис культуры или же образование отдельных негативных колоний. Титр полученных препаратов бактериофага определяли методом агаровых слоев [1].

Чистые линии фагов выделяли по общепринятой в настоящее время схеме: используя метод агаровых слоев, получали изолированные негативные колонии бактериофага.

Однотипные по морфологии колонии платиновой иглой вносили в среду SM и после десятикратных серийных разведений высевали на газон индикаторной культуры.

Эту операцию повторяли до 10 пассажей для получения стабильных форм негативных колоний. Полученные таким образом препараты бактериальных вирусов имели титр пХЮ1″ бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл).

Результаты исследований. Исследовав шесть образцов почвы, выделили 11 бактериофагов. Из четырех проб почвы, взятых в конце весны — начале лета на скотомочильнике, выделили 7 фагов: из одной пробы на культурах Вас. cereus и Вас. subtilis, из другой — Вас. pumilus и Вас. thuringiensis, из третьей — Вас. megatherium и Вас. cereus, из четвертой — Вас. anthracis из почвы с огорода и с пашни выделили по одному фагу — соответственно Вас. mycoides и Вас. cereus.

Из почвы, взятой в тех же местах в конце лета, только из двух проб выделили по одному фагу на культурах Вас. cereus и Вас. thuringiensis. Из остальных проб фаги выделить не удалось.

Опыты показали, что частота обнаружения свободного фага в почве находится в определенной зависимости от сезона года. В конце весны — начале лета бактериальные вирусы выявлены во всех шести исследованных пробах.

Из проб почвы, взятых в тех же местах, но в конце лета, выделили только два бактериофага. По-видимому, весной в почве всегда больше легкодоступных органических веществ, в результате чего происходит вегетация спор и, как следствие, лизис некоторых из лизогенных клеток и накопление в почве свободных частиц фага.

Постепенное расходование питательных веществ к концу лета и параллельное накопление в почве антибиотических веществ приводят к понижению активности клеток, последующему спорообразованию и гибели свободных фаговых частиц. При изучении спектра литического действия выделенных бактериальных вирусов на 27 штаммах бацилл у 9 установлена строгая специфичность.

У выделенных бактериальных вирусов наблюдали негативные колонии двух основных морфологических типов: прозрачные, с четко выраженными краями, диаметром до 2 мм, без видимого вторичного роста в центре и мутные негативные, с наличием вторичного роста. .

При изучении процесса адсорбции у некоторых из выделенных бактериальных вирусов установлено, что близкородственные бактериофаги САМ (cereus—anthracis-mycoides) адсорбируются на клетках примерно с одинаковой скоростью (табл.).

Время максимальной адсорбции бактериофага под номеров 1 на штамме Вас. cereus 96 составляло 11 мин, а для бактериофага № 4 на вакцинном штамме Вас. anthracis СТИ — 13 мин, такое же время максимальной адсорбции было и у бактериофага № 5 на штамме Вас. mycoides: L-5. Максимальная адсорбция у изученных фагов составляла 94—98 %.

Полученные данные свидетельствуют о широком распространении в природе фагов аэробных спорообразующих бактерий.

Заключение. Из различных образцов почвы выделено 11 бактериофагов аэробных спорообразующих бактерий. Строгая специфичность процесса фаголизиса установлена у 9 выделенных бактериальных вирусов.

Вас также заинтересует это:

Comments (0)

Комментариев нет

Нет комментариев.

Добавить комментарий

Имя (required)

Е-маил (required)

Сайт