22.12.2013
ВЕТЕРИНАРНАЯ ДЕЗИНФЕКЦИЯ
Рубрика: ПрофилактикаАвтор: admin
А. А. ПОЛЯКОВ, А. В. КУЛИКОВСКИЙ
Почти 40 лет прошло с опубликования в журнале статьи «Теория и практика ветеринарной дезинфекции» («Ветеринария, 1950, 8). За этот период дезинфекция заняла важное место в системе мероприятий, направленных на профилактику и борьбу с инфекционными болезнями животных.
Большую роль в ее развитии сыграли фундаментальные исследования, которые помогли научно обосновать целесообразность применения на практике различных дезинфицирующих средств, выбор оптимальных режимов дезинфекции и направления научного поиска наиболее эффективных препаратов.
Многолетние электронно-микроскопические исследования патогенных для животных бактерий во ВНИИ ветеринарной санитарии позволили получить четкое представление об их строении.
Так, грамотрицательные микроорганизмы (возбудители колибактериоза, сальмонеллеза, бруцеллеза и др.) имеют трехслойную клеточную стенку, расположенную под ней цитоплазматическую мембрану, гранулярную цитоплазму и тонкофибриллярный нуклеоид. Деление бактерий этой группы осуществляется простой перетяжкой.
Грамположительные бактерии (стафилококки, стрептококки, возбудители листериоза, рожи свиней и др.) имеют, как правило, гомогенную, более толстую клеточную стенку, чем грамотрицательные. На ее поверхности можно наблюдать элемент капсулы. В цитоплазме бактерий расположены хорошо развитые комплексы мембранных структур и деление клеток происходит путем формирования поперечной перегородки.
Эти сведения были подтверждены биохимическими исследованиями. Установлено, что у грамотрицательных бактерий клеточная стенка составляет 6—9 % от сухой массы клетки и состоит из большого количества липопротеидов (до 80 %), причем из них 20—40 % приходится на липосахариды и фосфолипиды, у грамположительных она достигает 20 % от сухой массы клеток и в основном (до 50 % всей массы клеточной стенки) состоит из мукопептидов. Количество липидов в них примерно около 2 %.
Отмечено также, что клеточная стенка грамположительных микроорганизмов за счет развитого мукопептидного слоя более прочная. Однако роль ее в жизнедеятельности бактерий изучена еще недостаточно.
Ее ингибирование антибактериальными препаратами (например, антибиотиками) эффективно используется в борьбе с патогенными бактериями. В то же время микроорганизмы, лишенные клеточной стенки, способны активно размножаться и даже давать сферопласты в потомстве.
Цитоплазматическая мембрана изучена детально. Она состоит из двух белковых слоев, между которыми находится бимолекулярый слой липидов. Белки составляют 60—65 %, липиды — 30—35 и углеводы — 2 % вещества мембраны. Липопротеидный комплекс достигает 90 % от всех химических веществ, входящих в состав мембраны.
Кроме того, в ней обнаружен комплекс ферментов (сукцинатдегидрогеназа, АТФаза и др.). Мембрана играет большую роль в поддержании осмотического барьера, синтезе белков, делении клетки, токсикогенезе и других жизненно важных процессах микробной клетки.
Цитоплазма бактерий состоит из гранулрибосом, количество которых колеблется от 20 до 30 тыс., объединяясь, они образуют полирибосомы. В состав рибосом входит РНК и белок, основная функция их в клетке — синтез белка.
Особое значение имеют споры бактерий. Известно, что они устойчивы к воздействию физико-химических факторов и могут выживать длительное время во внешней среде. Описано 9 морфологических стадий формирования споры (на примере Вас. сегеиБ).
Зрелая спора имеет экзоспориум, многослойную споровую оболочку, наружную мембрану, кортекс и протопласт, заключенный в спороплазматическую мембрану.
Криптобиотическое состояние, в котором находятся споры, представляет общебиологический интерес, и выход спор из этого состояния связан с активизацией деятельности ферментов.
По сравнению с вегетативными клетками в спорах бактерий содержится в 7 раз больше кальция, в 5 — алюминия, в 2 раза — железа. Установлено, что споровая оболочка достигает 50 % от общего объема споры, а в ее состав входят около 3 % золы, фосфор и липиды (по 3 %) и белок — от 35 до 80 %.
Споропласт является главным местом локализации энзимов, рибосом, РНК и ДНК. Его растворимая фракция содержит до 15 % дипиколиновой кислоты (ДПК), которая обнаружена только в спорах. Эта кислота синтезируется непосредственно перед образованием феномена термоустойчивости спор и полностью исчезает при их прорастании.
Особое положение среди микроорганизмов занимают микобактерии туберкулеза. По устойчивости к дезинфицирующим средствам они превосходят грамотрицательные и грамположительные бактерии и уступают в этом отношении только спорам.
Клетки микобактерий туберкулеза в колониях окружены развитым покровом, природа которого еще плохо изучена. Химическим анализом поверхностных структур микобактерий туберкулеза выявлены содержащиеся в них полисахариды, липиды и воск различных видов.
Структурно-биохимическими исследованиями, проведенными нами в последние годы, установлены особенности механизма действия дезсредств на бактерии. В частности, препарат збруч (моюще-дезинфицирующее средство) оказывал более выраженное бактерицидное действие на грамположительные бактерии (стафилококки), чем на грамотрицательные (кишечная палочка).
Это объясняется быстрым проникновением алкилсульфата натрия (одно из активно действующих веществ препарата) через мукопептидные комплексы клеточной стенки стафилококков. При воздействии на кишечную палочку препарат вступает во взаимодействие с липидами клеточной стенки, которые несколько замедляют поступление его внутрь клетки.
Но главной «мишенью» для алкилсульфата натрия в бактериальной клетке является цитоплазматическая мембрана. Анатомическое и химическое строение ее примерно одинаково у грамположительных и грам-отрицательных бактерий.
При контакте с этим органоидом клетки, который содержит различные ферментные группы, препарат прежде всего резко угнетает дыхательную и гликолитическую активность бактерий, вступает в химическое воздействие с липидами цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению ее основной функции — поддержанию барьера проницаемости. Это вызывает «утечку» жизненно важных внутриклеточных веществ.
При воздействии высокой температуры клеточная стенка бактерий, по-видимому, не выполняет защитную функцию. Так, в наших исследованиях доказано, что кишечная палочка и стафилококк обладают примерно одинаковой термоустойчивостью и их гибель не связана с разрушением клеточной стенки. В данном случае нарушается проницаемость цитоплазматической мембраны. При этом контуры мембраны выглядят размытыми, а цитоплазма бактерий — разреженной. Оптическая плотность клеток снижается, что свидетельствует об изменении их размеров, «утечкер содержимого и т. д.
При воздействии высокой температуры установлены два типа повреждения мембраны: первый — с «растапливанием» ее липидов, второй — с физическим повреждением, приводящим к образованию в ней небольших отверстий.
Вероятно, первый тип встречается при воздействии температуры выше 50 °С, например при кипячении. Это объясняется тем, что только у трех жирных кислот, входящих в состав цитоплазматической мембраны (каприновой, лауриновой, олеиновой), температуры плавления ниже 50 °С (О. Лири, 1977).
Гибель бактерий при температуре 50 С сопровождается понижением электронно-оптической плотности цитоплазмы. Подобное явление отмечено и при воздействии на клетки более высокой температуры (100 °С).
Биохимическими исследованиями доказано, что РНК, находящаяся в цитоплазме бактерий, деградирует при воздействии высокой температуры (от 55 °С и выше). Кроме того, в цитоплазме наблюдают денатурацию белкового компонента рибосом.
Денатурация ДНК бактерий наступает при более высокой температуре (от 80 °С и выше). В этом аспекте объяснить гибель бактерий при кипячении можно единым термином ;— «общая денатурация», что будет включать денатурацию белков, инактивацию ферментов, разрушение ДНК, РНК и т. д.
Структура бактериальных клеток после «кипячения» выглядит как бы фиксированной, то есть у клеток отсутствуют лити-ческие изменения, полностью угнетены дыхательные ферменты и гликозидазы, понижена электронно-оптическая плотность цитоплазмы.
Механизм гибели спор от воздействия высокой температуры несколько иной и во многом определяется их характерным химическим составом. В частности, дипиколи-новая кислота (ДПК) имеется только у спор и в большинстве случаев ее содержание в клетке коррелирует с термоустойчивостью спор.
Кроме того, определенную роль в термоустойчивости спор могут играть ионы металлов, особенно Мд+ и Са+ + . Их пропорция в сторону увеличения ионов Са+ + и уменьшения ионов Мд++ сопровождается повышением устойчивости спор к воздействию высокой температуры.
Ионы кальция и ДПК находятся в комплексе, который стабилизирует жизненно важные белки и нуклеиновые кислоты, как бы экранируя их от воздействия неблагоприятных факторов на спору. Отмечено, что диаминопимелиновая кислота (ДАПК) играет важную роль в термоустойчивости.
Она снабжена отрицательно заряженными группами, которые могут быть поперечно связаны с кальцием или с кальций-ДПК комплексом, что способствует поддержанию кортекса в ригидном состоянии.
Таким образом, в спорах найдены различные специфические вещества, которые поддерживают их термоустойчивость.
В настоящее время точно не установлено, какая из поверхностных структур споры ответственна за поддержание барьера проницаемости. Вероятнее всего — это спороплаз-матическая и кортикальная мембраны, из которых соответственно формируются цитоплазматическая мембрана и клеточная стенка вегетативной клетки.
Нельзя при этом полностью исключать возможную барьерную функцию кортекса. При нарушении барьера проницаемости спор нами установлено отсутствие в них ДПК и кальция, понижение электронно-оптическои плотности спороплазмы, инактивация споровых ферментов, которые более не экранируются Са-ДПК комплексом.
Учитывая, что спорообразующие микроорганизмы играют важную роль в инфекционной патологии животных, а споры чрезвычайно устойчивы к химическим препаратам, мы в течение ряда лет изучали механизм их .гибели, связанный с воздействием растворов дезинфицирующих средств (перекиси водорода, надуксусной кислоты, едкого натра и гипохлорита натрия), а также биоцидных газов (окиси этилена, бромистого метила и их смеси — ОКЭБМ).
Предварительно была тщательно изучена кинетика гибели микроорганизмов (на кривых выживаемости), которая позволила определить, что основная масса (до 99 %) микробной популяции погибает в первые 10—15 мин при воздействии дезинфектанта.
Оставшиеся споры могут противостоять дезинфектанту часами и сохранять жизнеспособность (подобное явление отмечено и у вегетативных клеток).
Установлено, что перекись водорода и надуксусная кислота вначале вызывают изменение в споровой оболочке и кортексе, которые богаты цистеином (его в 3—4 раза больше, чем в вегетативных клетках), и активированный кислород препаратов вступает в реакцию с дисульфидными группами этой аминокислоты. В дальнейшем, вероятно, нарушаются и другие связи белковых молекул (солевых, сложноэфирных, R—СО—ОН—R).
Кортекс по теории J. Lewis (1980) находится в сжатом (контрактильном) состоянии, которое поддерживается наличием в спорах Са-ДПК комплекса. При воздействии дезинфектантов из спор выходят Са и ДПК, что сопровождается деконтрактацией и набуханием кортекса. Это хорошо просматривается под электронным микроскопом, где кортекс выявляется в виде вспенившейся структуры.
Несмотря на то что активно действующее вещество изученных препаратов одинаковое, тем не менее мы установили, что перекись водорода значительно слабее действует на споры, в которых имеется ДПК, даже если у них нарушена целостность оболочек. При применении надуксусной кислоты целостность споровых оболочек играла главную роль в устойчивости спор к препарату.
Различие в механизме действия перекиси водорода и надуксусной кислоты на споры, по нашему мнению, заключается в следующем. Окисляя поверхностные структуры клеток, то есть акцептируя электроны, перекись водорода постепенно теряет свои дезинфекционные свойства.
Более того, вступая 8 активное взаимодействие с SH-группами белков оболочки, которые являются «донорами» электронов, и разлагаясь под воздействием каталазы спор, перекись водорода также понижает свою антимикробную активность.
Иначе протекает процесс при воздействии надуксусной кислоты: уксусная кислота, ко-
торая образуется при разложении дезинфектанта, диссоциирует на Н+ ионы и кислотный остаток, резко сдвигая рН среды в кислую сторону. Катионы водорода активно устремляются к споровой оболочке, имеющей отрицательный заряд, нейтрализуя полярные группы белков (СОО-) и расслабляя энергетический барьер для более легкого прохождения активированного кислорода перекиси водорода в клетку.
Кроме того, при кислом рН происходит ингибирование споровой каталазы, что предотвращает нейтрализацию препарата. Данное синергическое действие активированного кислорода и катионов водорода обеспечивает чрезвычайно высокую спороцидную способность надуксусной кислоты (примерно в 20 раз большую, чем перекись водорода).
К особой группе химических дезинфектантов относятся газы (окись этилена, бромистый метил и их смесь). Их применяют в том случае, когда невозможно обеззаразить объект традиционными методами. Исследования ультраструктурных изменений спор при воздействии этих газов позволили нам установить, что спороцидный эффект окиси этилена и ОКЭБМ сопровождается прорастанием клеток.
Такой процесс отчетливо просматривается под электронным микроскопом. При начальном воздействии газов споры Вас. anthracis теряли слоистость экзоспориума и споровой оболочки, кортекс их набухал, спороплазма становилась гранулярной. В дальнейшем внутри спор формировались молодые вегетативные клетки, имеющие хорошо выраженную клеточную стенку, цитоплазма-тическую мембрану, зернистую цитоплазму и тонкофибриллярный нуклеоид.
Известно, что молекула окиси этилена, обладая высокой реакционной способностью, легко вступает во взаимодействие со многими белковыми молекулами микробной клетки, алкилируя карбоксильные, аминные, сульфгидрильные и гидроксильные группы.
Окись этилена также реагирует с ДНК, алкилируя один или несколько атомов азота в основании этой кислоты, что вызывает нарушение в спаривании спирали ДНК. Возможно, что, проникнув в глубь споры, окись этилена затрагивает те участки молекулы ДНК, которые ответственны за инициацию прорастания споры и превращение ее в вегетативную клетку, то есть как бы активизирует этот процесс. Появившиеся вегетативные клетки быстро погибают от воздействия газа.
В отличие от окиси этилена бромистый метил не вызывал активного прорастания спор, что свидетельствует о его слабом воздействии на «пусковые» механизмы активации и объясняет менее выраженную спороцидную активность препарата.
Смесь этих газов (ОКЭБМ) обладает высокой спороцидной активностью, и ее влияние на клетку носит комплексный характер: воздействие окиси этилена, бромистого метила, смеси радикалов и ионов этих веществ, а также токсических продуктов,, образующихся в результате взаимодействия газов со спорами.
Исследования, проведенные нами на мутантах спор, показали, что спороцидная активность изученных газов повышается в следующем порядке: бромистый метил —>-ОКЭБМ—»-окись этилена. Эти различия, на наш взгляд, зависят от проникающей способности газов через покровы спор.
Мутанты спор с дефектными оболочками оказались наиболее чувствительными к воздействию биоцидных газов. Роль дипиколиновой кислоты (ДПК) в механизме устойчивости спор к газам мало выражена. Так, мутанты спор, дефицитные по ДПК, были наиболее устойчивы к газам.
Данные факторы подтверждают мысль о том, что механизм устойчивости и гибели микроорганизмов при воздействии дезинфицирующих средств многообразен и не всегда может быть объяснен лишь поражением какой-то единичной «мишени» в клетке или присутствием (отсутствием) какого-либо жизненно важного вещества.
С расширением спектра исследований удается проследить многообразие процессов, протекающих в микробной клетке при воздействии дезинфектантов. Нами совместно с американскими исследователями (Мичиганский штатный университет) установлено, что при применении едкого натра и гипохлорита кальция в спорах Bas. cereus изменялись поверхностные структуры экзоспориума, споровая оболочка и кортекс, а в дальнейшем и спороплазма, которая полностью теряла свою гранулярность.
Структурные нарушения сопровождались выходом из клеток белка, нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), кальция и дипиколиновой кислоты (ДПК). Изучение процесса гибели спор в динамике и наложение данных биохимического анализа и ультраструктурных изменений на кривые отмирания клеток при воздействии дезинфектанта позволили нам объяснить сложный механизм гибели спор.
При этом, очевидно, нарушается барьер проницаемости, так как вещества с крупной молекулой (белки, нуклеиновые кислоты) могут свободно выходить из клетки при функциональном повреждении цитоплазматической мембраны. «Утечка» из спор кальция и ДПК для спор не «смертельна» как таковая, но уменьшение их уровня в спорах резко снижает защитный комплекс последних и провоцирует их прорастание.
Другими словами, находясь в анабиотическом состоянии, внутренние структуры спор трудно досягаемы для губительных агентов, и только при определенных структурно-функциональных изменениях в поверхностных структурах, «утечке» из них кальция и ДПК они становятся чувствительными к дезинфектантам.
Многолетние исследования показали, что гибель микроорганизмов при воздействии дезинфицирующих средств может быть проиллюстрирована крйвой выживаемости. При этом бактерицидные (спороцидные) концентрации дезинфектантов вызывают гибель до 99 % микробной популяции в первые минуты воздействия.
Для достижения полного дезинфекционного эффекта (то есть 100%-ной гибели) следует продлить время до 2—3 ч.
Таким образом, микробную популяцию условно можно разделить на две группы: клетки с «нормальной» устойчивостью, которые гибнут в первые минуты и представляют основную массу, и микроорганизмы с выраженной устойчивостью к дезинфектантам.
Последняя группа клеток немногочисленна, но наиболее важна для практической дезинфекции, так как именно на эту группу резистентных бактерий рассчитаны существующие режимы обработки.
В то же время у этих устойчивых микроорганизмов почти не изучены механизм выживаемости и вирулентность. Если окажется, что эти микробы с наибольшей выживаемостью не смогут вызвать заболевание у животного, то необходимо будет научно обосновать существующую концепцию полного уничтожения патогенных бактерий при дезинфекции, а следовательно, и предлагаемых режимов.
Исследования последних лет показали, что микроорганизмы, взятые в качестве тест-бактерий (стафилококк и кишечная палочка) при подборе режимов дезинфекции и используемые для контроля ее качества, не являются универсальными. Так, с появлением новой группы дезинфицирующих поверхностно-активных веществ (катион- и анионные ПАВ) наши представления об устойчивости названных бактерий изменились.
Оказалось, что стафилококк более чувствителен к этим препаратам, чем кишечная палочка. То есть уничтожение стафилококка в данном случае не говорит о хорошем качестве дезинфекции, так как при этом может выживать патогенная грамотрицательная микрофлора.
Другой важный вопрос — изыскание высокоэффективных бактерицидов. Полученные данные по структурно-функциональным изменениям бактерий показали, что клетки при воздействии дезинфектантов гибнут в том случае, когда препарат проникает через клеточную стенку и достигает цитоплазмати-ческой мембраны.
Последняя является местом локализации многих ферментов микробной клетки, которые подавляются (инактивируются) почти всеми известными химическими дезинфицирующими препаратами.
Тем не менее необратимые изменения микробной клетки, приводящие к ее гибели, наступают при нарушении главной функции цитоплазматиче-ской мембраны — поддержания барьера проницаемости. Это влечет за собой выход из клеток жизненно — важных растворимых компонентов и проникновение внутрь дезинфицирующего средства.
В связи с этим при поиске эффективного дезинфицирующего средства прежде всего следует обращать внимание на его способность быстро проникать через клеточные стенки бактерий и цитоплазматическую мембрану.
Такую способность дезинфектанта могут активировать:
— сдвиг рН препарата в кислую или основную сторону (в зависимости от его химической совместимости), что поможет преодолеть дезинфектанту поверхностный электростатический барьер микробной клетки;
— добавление к препарату поверхностно-активных веществ (анионактивного неино-генного или катионактивного, в зависимости от его химической совместимости), которые оказывают разрушающее действие на цитоплазматическую мембрану;
— нагревание растворов дезинфицирующих средств, так как высокая температура (50 «С и выше) существенно влияет на целостность барьера проницаемости бактерий и способствует более активному проникновению дезинфектанта в глубь клетки.
Что касается спор, то проникающая способность дезинфектанта через их покровы и нарушение барьера их проницаемости также играют решающую роль в достижении спороцидного эффекта.
Вещества, не обладающие этой способностью (например, спирт, поверхностно-активные вещества и др.), являются лишь бактерицидами и не действуют губительно на споры. Поэтому принципы активизации дезинфицирующих средств, названные выше, приемлемы и при подборе эффективных спороцидов.
Кратковременное воздействие на споры (прогрев при 90 °С, обработка растворами дезинфицирующих средств, окисью этилена и т. д.) будет способствовать их активации и переходу в состояние, характерное по устойчивости для вегетативных клеток. Данный момент важен для теоретического обоснования «двухступенчатой» дезинфекции при споровых инфекциях.
Первая ступень — нарушение барьера проницаемости спор, выход из анабиотического состояния, что требует кратковременного, но сильного воздействия на клетку, вторая ступень — уничтожение активированных спор в «мягких» режимах дезинфекции, рассчитанных на вегетативные клетки.
В заключение следует отметить, что химические средства, применяемые для дезинфекции, будут проходить более жесткую экспертизу. Требования, которые предъявлялись к ним, до сих пор остаются важными, но наиболее актуальной в настоящее время является их экологическая безопасность.
В связи с этим назрела необходимость критического пересмотра применяемых на практике дезинфектантов, а самое главное — надо изыскать новые препараты, отвечающие современным требованиям. Целесообразно начать развитие «биологической» дезинфекции, основанной на использовании фагов, антагонистов, биологических свойств растений, которые могут уничтожать патогенные микроорганизмы во внешней среде.
Вас также заинтересует это:
Comments (0)
Комментариев нет
Нет комментариев.
