07.10.2013
Сыворотка к иммуноглобулинам
Рубрика: ВетпрепаратыАвтор: admin
ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ
В. М. ЖАВНЕНКО, А. МОГИЛЕНКО
Витебский ветеринарный институт
Количественное соотношение классов иммуноглобулинов сыворотки крови у животных различных возрастных групп сразу после рождения — показатель иммунобиологического статуса организма на отдельных этапах онтогенеза и при различных патологических состояниях.
Количественное определение иммуноглобулинов G, М, А классов основано на использовании моноспецифических сывороток (Маncini et al., 1963; Fahey, 1965).
Целью настоящей работы было усовершенствование выделения чистых иммуноглобулинов и получение соответствующих антисывороток.
Для выделения отдельных классов иммуноглобулинов использовали следующие методы: физико-химические — осаждение глобулиновой фракции сыворотки крови натрия сульфатом; предварительное выделение отдельных классов иммуноглобулинов путем осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000; электрофорез препаративный и аналитический; и иммунологические — иммуноэлектрофорез — для определения чистоты выделенных иммуноглобулинов и оценки специфичности полученных антисывороток (Грабар, Буртан, 1963); метод радиальной иммунодиффузии — для количественного исследования иммуноглобулинов с использованием кроличьих моноспецифических антисывороток.
Для получения иммуноглобулинов как антигенов для иммунизации в качестве исходного материала использовали смесь сывороток крови здорового клинически КРС возрастом 3—5 лет. Сыворотку предварительно фракционировали с целью выделения V-глобулина (работать можно с любым объемом сыворотки).
Для этого к 100 мл сыворотки добавляли 18 г Na2S04. Осаждение проводили при обычной температуре (комнатной), так как при охлаждении растворимость натрия сульфата уменьшается.
Полученную смесь центрифугировали при 6000 об/мин 15 мин. Осадок растворяли в 40 мл фосфатного буфера (М 0,1; рН 8). Раствор центрифугировали и нерастворившийся осадок удаляли, а к надосадочной жидкости вновь добавляли 4,8 г Na2S04. Полученный осадок отделяли центрифугированием и вновь растворяли в 20 мл того же буфера. После очередного центрифугирования к раствору еще раз добавляли NajSOi — 2,4 г. Выпавший осадок отделяли, растворяли в буфере и подвергали диализу против физиологического раствора.
Чистоту у-глобулинов проверяли методом аналитического электрофореза на пластинке агара. Гамма-глобулиновая фракция не должна содержать анодных примесей. В случае наличия последних предварительное фракционирование повторяли.
К концентрату глобулиновой фракции добавляли ПЭГ-6000 до 5 % (масса/объем). Эту смесь центрифугировали и из надосадочной жидкости первым выделяли IgM путем добавления ПЭГ-6000 до 6 %. При этом учитывали предварительное насыщение полиэтиленгликолем. Путем центрифугирования отделяли осадок, а потом растворяли в физрастворе до необходимой концентрации.
IgG получали путем добавления ПЭГ-6000 до 12 %. Также добавляли физраствор.
JgA выделяли путем добавления ПЭГ-6000 до 14%. Осадок также растворяли физраствором.
Чистоту полученных фракций контролировали аналитическим электрофорезом на пластинке агара. При этом, как обычно, отмечали загрязнение фракций агмакроглобулинами (анодная фракция).
Дальнейшую очистку проводили путем препаративного гельэлектрофореза на 0,1 М трис-НС-буфере рН8 при 100 мА на пластину (9X12 см ) в течение 2—2,5 ч. Катодные фракции вырезали вместе с агаром и помещали в центрифужные стаканы, замораживали, а затем центрифугировали до полного размораживания при 6000 об/мин. При этом белки элюировали с агара в надосадочную жидкость, которую и использовали.
Чистоту выделенных таким образом иммуноглобулинов G, М, А классов контролировали в иммуноэлектрофорезе на стеклянных пластинках размером 9X12 см2 в 1 %-ном агаровом геле (тип USA) на 0,1 М мединалацетатном буфере рН 8,6 в течение 45 мин при силе тока 5 мА/см с антисывороткой против белков, сыворотки крови КРС.
Выделенные и очищенные таким способом IgG, IgM, IgA оказались иммунохимически чистыми. Их собирали и концентрировали в диализных мешочках против ПЭГ-40 000, расфасовывали и хранили в замороженном состоянии.
Моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам отдельных классов получали по следующей схеме: кроликам массой 2,5— 3 кг три дня подряд под конъюнктиву глаза вводили по 0,1 мл раствора (2 мг в 1 мл ) антигена и после 3-дневного перерыва инъекции повторяли. Затем опять после 3-дневного перерыва антиген вводили еще три дня в дозе, увеличенной в 2 раза. Спустя 7—10 дней после инъекции брали кровь и определяли титр сыворотки в реакции диффузионной преципитации.
Он составлял для антисыворотки к иммуноглобулинам класса в 1:16—1:32, А—1:8—1:16, М—1:4—1:8. Затем из ушной вены у каждого гипер-иммунизированного кролика, предварительно смазав поверхность уха ксилолом, брали по 40—60 мл крови и получали сыворотку, фасовали ее во флаконы по 5 мл и хранили при —20 °С.
Кроликов, сыворотка крови которых содержала антитела в высоком титре, использовали в качестве доноров. Реиммунизировали их аналогичным антигеном через два месяца.
Схема выделения иммуноглобулинов разных классов, основанная на комбинировании физико-химических методов, позволила получить их в иммунохимически чистом виде. При этом каждый препарат иммуноглобулина при иммуноэлектрофорезе с антисывороткой /к белкам сыворотки крови КРС давал только одну характерную линию преципитации.
Использование этого метода возможно практически с любым количеством сборной сыворотки, что позволяет получать иммуноглобулины в достаточных количествах. Все это очень важно при получении соответствующих антисывороток. Кроме этого, процедура выделения относительно непродолжительна по времени и потери белка незначительны.
Получаемые антисыворотки достаточно активны в РИД.
Вас также заинтересует это:
Comments (0)
Комментариев нет
Нет комментариев.
